2026年6月15日，成都大学余小平团队、中国人民解放军西部战区总医院邓涛团队等，联合成都中医药大学、成都医学院等单位，在 Phytomedicine（中科院1区，TOP期刊，IF=11.3）发表题为“Delphinidin Targets Voltage-Dependent Anion Channel 1 to Inhibit Ferroptosis and Protect Against Retinal Photochemical Damage”的研究论文。该文于2026年1月14日投稿，2026年5月22日修回，2026年6月15日接收。
该研究聚焦视网膜光化学损伤（RPD）中线粒体损伤、先天免疫激活与铁死亡之间的联系。研究团队发现，飞燕草素（delphinidin）可直接靶向电压依赖性阴离子通道1（VDAC1），抑制光损伤诱导的VDAC1羰基化和寡聚化，从而减少线粒体DNA外泄，抑制cGAS-STING通路激活，维持GPX4蛋白水平，最终减轻铁死亡和视网膜组织损伤。该研究为理解RPD的分子机制及开发针对性干预策略提供了新的实验依据。
【摘要】
背景：视网膜光化学损伤的分子基础尚未完全明确，这限制了靶向治疗策略的发展。飞燕草素是一种具有保护作用报道的花色苷元类化合物，具有一定研究潜力，但其直接分子靶点和作用机制仍不清楚。
方法：研究采用活性基团蛋白质组学（ABPP）、药物亲和响应靶标稳定性-质谱（DARTS-MS）、表面等离子体共振（SPR）和细胞热转变实验（CETSA）鉴定飞燕草素的分子靶点。随后在661W感光细胞和Sprague-Dawley大鼠光诱导视网膜损伤模型中评估其功能作用。研究利用炔基苯胺探针检测蛋白羰基化，并通过化学交联分析电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）寡聚化。同时检测线粒体功能、cGAS-STING通路激活以及铁死亡相关标志物，以阐明其潜在机制。
结果：研究确认VDAC1是飞燕草素的直接靶点。光照可诱导VDAC1发生羰基化和寡聚化，导致线粒体功能障碍，表现为细胞色素c释放以及线粒体DNA（mtDNA）泄漏至细胞质。细胞质中的mtDNA进一步激活cGAS-STING通路，促进铁死亡抑制因子GPX4减少，并触发铁死亡。飞燕草素通过结合VDAC1并抑制其羰基化和寡聚化，阻断这一级联反应，从而限制mtDNA泄漏、减弱cGAS-STING通路激活、维持GPX4丰度并抑制铁死亡。在体内实验中，飞燕草素干预表现出显著保护作用，具体体现为视网膜组织结构得到保留，氧化损伤和铁死亡减轻。
结论：本研究揭示了RPD中一条新的机制轴，即VDAC1异常与mtDNA驱动的先天免疫激活及铁死亡之间的联系。同时，研究确定飞燕草素是一种直接靶向VDAC1的化合物，并提示其在预防RPD方面具有潜在应用价值。
01研究背景及科学问题
视网膜是视觉感知的核心组织，其功能依赖于光信号转导与代谢稳态的协调维持。然而，由于视网膜长期暴露于可见光环境中，其组织结构尤其容易受到光化学损伤。视网膜光化学损伤（RPD）是指过度光照引发一系列光物理和光化学反应，最终导致视网膜细胞结构破坏和功能下降的病理过程。
越来越多研究表明，RPD是多种致盲性眼病发生和进展的重要环境因素，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、部分类型青光眼以及光性视网膜病变等。在这些疾病的早期和进展阶段，光诱导的氧化应激以及继发性炎症反应、凋亡和坏死可加速视网膜神经元及色素上皮细胞丢失，最终导致不可逆视觉损伤。因此，更清楚地理解RPD的分子基础，对于寻找有效干预靶点和开发视网膜疾病保护策略具有重要意义。
视网膜具有极高的代谢需求，这主要源于感光细胞将光刺激转换为神经信号的电生理过程。因此，线粒体完整性对维持视网膜稳态至关重要，尤其是高度依赖线粒体能量代谢的感光细胞。除作为细胞“能量工厂”外，线粒体还是调控氧化还原平衡和细胞死亡信号的重要细胞器。一旦线粒体膜完整性受损、代谢活性下降或活性氧（ROS）过度生成，均可能对视网膜细胞存活造成深远影响。
电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是位于线粒体外膜的主要通道蛋白，负责代谢物和能量底物交换，并在生理条件下整合促生存信号。然而在氧化应激状态下，VDAC1容易发生羰基化修饰，这种修饰可促进其寡聚化。寡聚化VDAC1能够形成较大的非选择性孔道，导致线粒体内容物泄漏、炎症信号激活和细胞死亡。因此，VDAC1位于氧化应激、线粒体功能障碍与细胞命运调控的交汇点。
花色苷元是一类广泛存在于植物中的水溶性多酚化合物，具有苯并吡喃阳离子核心结构。自然界中常见的六种主要花色苷元包括天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药素、牵牛花素和锦葵素。已有证据提示，花色苷元对视网膜具有保护作用。其抗氧化特性使其能够清除多种ROS，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧自由基。研究还显示，花色苷元对DPPH自由基、超氧阴离子和羟自由基均具有明显清除活性。
此外，花色苷元可能有助于维持线粒体功能。考虑到线粒体是细胞内ROS的重要来源，这一点尤为关键。已有研究报道，这类化合物能够改善线粒体稳态、减轻细胞器损伤并恢复代谢功能。例如，在心肌缺血再灌注损伤中，花色苷元可通过直接或间接机制维持线粒体稳态。在视网膜损伤模型中，来源于马基莓（Aristotelia chilensis）的飞燕草素可减轻蓝光诱导的661W小鼠感光细胞亚细胞损伤，降低线粒体碎裂，改善ATP相关呼吸，并增强细胞存活。尽管这些发现具有启发意义，但花色苷元在视网膜中的保护作用仍未被充分阐明，主要原因在于其直接分子靶点尚不明确。
本研究聚焦具有较强抗氧化活性的飞燕草素。研究团队通过活性基团蛋白质组学（ABPP）和药物亲和响应靶标稳定性-质谱（DARTS-MS）发现，VDAC1是飞燕草素的直接分子靶点。机制上，飞燕草素可抑制VDAC1羰基化并限制其寡聚化，从而维持线粒体膜完整性，减少线粒体泄漏信号，并抑制mtDNA-cGAS-STING通路激活，最终抑制光诱导铁死亡。
02重要发现及亮点
飞燕草素抑制铁死亡并保护视网膜免受光化学损伤
为探索RPD的潜在机制，研究团队首先基于转录组数据集GSE214298中的差异表达基因开展GO和KEGG富集分析。KEGG通路分析提示，光照可在661W视网膜感光细胞中诱导与铁死亡相关的转录程序。为进一步验证铁死亡在该过程中的功能意义，研究分别使用铁死亡抑制剂DFO或飞燕草素处理细胞，并通过CCK-8检测细胞活力。结果显示，两种干预均显著减轻光诱导的细胞损伤。
结晶紫染色和相差显微镜观察进一步显示，光照显著降低661W细胞密度，而飞燕草素处理可恢复细胞生长和存活。为明确细胞死亡情况，研究结合Calcein-AM/PI活死细胞染色、荧光显微成像和流式细胞术进行检测，发现飞燕草素显著抑制光诱导的细胞死亡。JC-1染色显示，飞燕草素还可恢复被光照降低的线粒体膜电位。
铁死亡的重要特征包括细胞内二价铁积累及由此导致的脂质ROS升高。进一步检测发现，飞燕草素显著降低光照细胞中的二价铁积累和脂质ROS水平。铁死亡相关蛋白的免疫印迹分析显示，飞燕草素降低PTGS2表达，提高FTH1丰度，并恢复GPX4蛋白水平。透射电镜观察也显示，光照诱导661W细胞出现典型铁死亡样线粒体改变，包括线粒体嵴缩小和电子密度增加；飞燕草素和DFO均可有效改善这些线粒体异常。
图1：飞燕草素抑制铁死亡并保护视网膜免受光化学损伤。（A-B）对视网膜光化学损伤中差异表达基因（DEGs）进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。DEG筛选阈值为：校正后p < 0.05，|log₂FC| > 0.585，假发现率采用Benjamini-Hochberg方法校正。（C-L）661W细胞处理48 h，分为4组：Control组（正常培养）、Light组（2600 lux光照）、Light+DP-L组（光照 + 2.5 μM飞燕草素）、Light+DP-H组（光照 + 5 μM飞燕草素）。（C）结晶紫染色。（D）相差显微镜图像。比例尺 = 100 μm。（E）Calcein-AM（绿色）/PI（红色）双染。比例尺 = 100 μm。（F）JC-1染色（共聚焦显微镜）。比例尺 = 10 μm。（G）FerroOrange染色。比例尺 = 10 μm。（H-K）流式细胞术分析细胞活力、线粒体膜电位（MMP）、脂质ROS和二价铁（Fe²⁺）水平。（L）Western blot（WB）分析铁死亡相关蛋白PTGS2、FTH1和GPX4。（H-L）结果以均值 ± SEM表示，n=3次独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Light组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
飞燕草素增强661W视网膜感光细胞的抗铁死亡能力
为明确铁死亡在661W细胞损伤中的直接作用，研究使用经典铁死亡诱导剂erastin建立铁死亡模型。CCK-8结果显示，erastin显著降低细胞活力，而与飞燕草素联合处理可逆转这一影响，提示飞燕草素具有抗铁死亡作用。
免疫印迹结果显示，在erastin处理的细胞中，飞燕草素显著调节关键铁死亡相关蛋白表达。功能检测进一步支持这一保护作用：飞燕草素显著降低erastin诱导的细胞死亡，恢复JC-1染色所反映的线粒体膜电位，并减轻细胞内铁积累和脂质ROS生成。
图2：飞燕草素增强661W视网膜感光细胞的抗铁死亡能力。（A）CCK-8检测不同浓度erastin处理661W细胞24 h后的细胞活力。数据以中位数（四分位距，IQR）表示，n=5次独立实验。***p < 0.001（Kruskal-Wallis H检验，并进行Dunn事后检验）。（B-H）细胞处理24 h，分为4组：Control组（正常培养）、Erastin组（5 μM erastin）、Erastin+DP-L组（5 μM erastin + 5 μM飞燕草素）、Erastin+DP-H组（5 μM erastin + 10 μM飞燕草素）。（B）CCK-8检测细胞活力。（C）结晶紫染色。（D）WB分析PTGS2、FTH1和GPX4。（E-H）流式细胞术分析细胞活力、MMP、脂质ROS和Fe²⁺水平。定量数据以均值 ± SEM表示，n=6（B）或n=3（D-H）次独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Erastin组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
通过ABPP鉴定飞燕草素的潜在靶点
为鉴定飞燕草素的直接分子靶点，研究团队合成了炔基功能化飞燕草素探针（Dp-P），即在母体化合物A环上引入炔基。首先，研究使用DPPH实验评估Dp-P的体外抗氧化活性。虽然对酚羟基进行修饰会使其抗氧化活性略有下降，但该探针仍保留足够生物活性，可用于靶点鉴定。由于探针设计的主要目的是引入报告基团以便捕获靶蛋白，例如生物素或荧光基团，而不是最大限度保留抗氧化效力，因此这种活性降低是可以接受的。
随后，研究在光诱导损伤模型和erastin诱导铁死亡模型中评估Dp-P的生物活性。CCK-8结果显示，Dp-P可在两种模型中恢复661W细胞活力，支持其用于化学蛋白质组学分析。靶点鉴定流程包括：661W视网膜感光细胞与不同浓度Dp-P孵育，随后通过SDS-PAGE分离探针结合蛋白。为评估结合特异性，细胞先用过量未标记飞燕草素预处理，再暴露于20 μM Dp-P。未标记飞燕草素预处理可降低多个蛋白条带的荧光强度，说明天然飞燕草素可竞争性置换探针对细胞内靶点的结合。
共聚焦荧光成像也显示，Dp-P在细胞内明显积累，而与未标记飞燕草素共同处理会削弱荧光信号。这一细胞竞争实验进一步支持天然飞燕草素和Dp-P作用于相同的细胞内结合位点。为更好解析飞燕草素结合蛋白谱，研究在点击化学连接生物素后进行pull-down实验，再经SDS-PAGE和银染分析。结果显示，飞燕草素预处理降低了富集蛋白条带的数量和强度，进一步确认其竞争性靶点结合。随后，富集蛋白被用于定量质谱分析以鉴定靶点。
图3：通过ABPP鉴定飞燕草素靶点。（A）飞燕草素及其探针（Dp-P）的化学结构。（B）DPPH自由基清除实验。（C-D）CCK-8检测Dp-P处理的661W细胞在光照模型（C）和erastin诱导铁死亡模型（D）中的细胞活力。数据以均值 ± SEM表示，n=4。（E）使用Dp-P探针进行靶点鉴定的流程示意图。（F-G）661W细胞中Dp-P标记蛋白的胶内荧光成像（F），以及过量飞燕草素预孵育后的竞争性抑制实验（G）。（H）共聚焦显微镜观察Dp-P（红色）在细胞内的分布及竞争性抑制实验。细胞核：DAPI（蓝色）。比例尺 = 10 μm。（I）经点击化学连接生物素的Dp-P pull-down蛋白银染及竞争性抑制实验。（J）pull-down样品（Dp-P组 vs. Dp-P + 飞燕草素竞争组）质谱结果散点图。每个点代表一个定量蛋白。x轴表示鉴定到的蛋白数量，y轴表示丰度变化的Log₂倍数变化（Log₂FC）（Dp-P/Competition）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Light组或Erastin组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
确认VDAC1是飞燕草素的分子靶点
为明确飞燕草素的直接分子靶点，研究团队进一步开展靶点筛选和验证。首先使用药物亲和响应靶标稳定性实验（DARTS）进行初筛。将661W细胞总蛋白提取物与DMSO或不同浓度飞燕草素（5、50、500 μM）在室温孵育1 h，再经Pronase E消化30 min。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色显示，在约35 kDa处出现一个随飞燕草素浓度升高而逐渐增强的蛋白条带。研究将该条带切胶并进行质谱鉴定。将DARTS候选蛋白与ABPP鉴定蛋白进行比较并开展Venn分析后，VDAC1被确定为共同候选靶点。
随后，研究对VDAC1进行进一步验证。DARTS结合免疫印迹显示，飞燕草素显著保护VDAC1免于蛋白酶降解，符合直接结合特征。使用生物素标记Dp-P探针的pull-down实验显示，飞燕草素预处理以剂量依赖方式降低VDAC1富集，支持天然化合物与探针之间存在竞争性结合。CETSA进一步显示，飞燕草素可提高细胞内VDAC1热稳定性，为直接靶点结合提供了额外证据。为更直接评估这一相互作用，研究使用重组VDAC1和Dp-P开展荧光竞争实验。Dp-P与VDAC1结合产生强荧光信号，而飞燕草素预处理可削弱该信号，说明二者竞争相同或重叠结合位点。最后，SPR定量确认飞燕草素与VDAC1之间存在相互作用，解离常数（KD）为5.98 μM。
图4：确认VDAC1是飞燕草素的分子靶点。（A）药物亲和响应靶标稳定性（DARTS）实验示意图。（B）DARTS实验产物的考马斯亮蓝染色。661W细胞裂解液先与DMSO或不同浓度飞燕草素（5、50、500 µM）预孵育，随后进行有限Pronase E消化。约35 kDa蛋白条带被切取用于质谱鉴定。（C）针对VDAC1的DARTS-WB实验。（D）使用生物素化Dp-P探针进行竞争性pull-down实验，随后通过WB检测VDAC1。（E-F）细胞热转变实验（CETSA）。（E）加热后可溶性VDAC1的代表性WB图。（F）可溶性VDAC1定量，n=3。（G）Dp-P探针（红色）与VDAC1免疫荧光（绿色）的原位竞争性结合及共定位实验。比例尺 = 50 µm。（H-I）使用重组VDAC1蛋白进行体外竞争性结合实验。（H）荧光检测Dp-P与重组VDAC1结合。（I）飞燕草素预孵育后的竞争性抑制实验。（J）飞燕草素与固定化VDAC1的表面等离子体共振（SPR）结合实验。
飞燕草素减轻VDAC1羰基化水平
氧化应激是视网膜损伤的重要驱动因素，而光照可在视网膜细胞中诱导蛋白羰基化。蛋白羰基化是一种常见的氧化修饰，常与蛋白结构不稳定和不可逆损伤相关。由于飞燕草素能够有效清除反应性羰基物质，而VDAC1又对氧化羰基化高度敏感，研究团队推测飞燕草素可能通过调节VDAC1羰基化状态保护视网膜细胞。
为检测蛋白羰基化，研究采用基于m-炔基苯胺（m-APA）的点击化学策略。在酸性条件下，m-APA的氨基与蛋白羰基形成Schiff碱中间体，并经NaBH₃CN还原形成稳定共价连接。随后通过点击化学连接TAMRA-N₃或biotin-N₃，实现羰基化蛋白的凝胶可视化或特异性富集。
通过TAMRA-N₃标记、SDS-PAGE和荧光成像，研究发现光照可提高661W细胞总蛋白羰基化水平。为判断VDAC1是否受到特异性影响，研究进一步用生物素标记羰基化蛋白，经pull-down富集后进行免疫印迹分析。结果显示，光照增加m-APA标记的VDAC1，而飞燕草素处理降低该信号。固定细胞共定位分析显示，飞燕草素降低VDAC1免疫荧光信号与m-APA标记羰基化信号之间的重叠，提示飞燕草素可抑制光诱导VDAC1羰基化。
由于蛋白羰基化也可能继发于脂质过氧化来源的醛类物质，例如4-羟基壬烯醛（4-HNE），研究进一步通过免疫印迹和免疫荧光检测4-HNE水平。结果显示，飞燕草素降低661W细胞中4-HNE积累，提示其还可能通过抑制脂质过氧化间接限制蛋白羰基化。
图5：飞燕草素改善VDAC1羰基化水平。（A）基于炔基苯胺（m-APA）的蛋白羰基化检测策略示意图。（B）总蛋白羰基化的荧光凝胶成像。（C）羰基化蛋白的生物素pull-down结合WB检测VDAC1羰基化。（D）荧光标记羰基化蛋白（红色）与VDAC1免疫荧光（绿色）的共定位实验。比例尺 = 10 μm。（E）WB分析4-HNE表达。（F）4-HNE免疫荧光染色。比例尺 = 50 μm。（G）根据WB结果定量4-HNE蛋白表达。定量数据（C、E）以均值 ± SEM表示，n=3次独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01（与Light组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
飞燕草素调控VDAC1寡聚化以抑制光诱导视网膜细胞铁死亡
VDAC1是线粒体外膜的主要通道蛋白。在氧化应激下，其羰基化修饰可诱导构象变化，促进单体聚集形成寡聚体。为判断这一机制是否参与光诱导视网膜损伤，研究首先检测VDAC1的寡聚状态。结果显示，光照增加661W细胞中VDAC1寡聚体形成，而飞燕草素有效抑制这一反应。VDAC1寡聚化选择性抑制剂VBIT-12也表现出类似抑制作用。此外，ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可阻断氧化应激及相关羰基化反应，同样显著减少VDAC1寡聚体形成。这说明在光诱导氧化应激下，VDAC1羰基化是促进其寡聚化的上游事件，而飞燕草素可通过限制VDAC1氧化修饰中断这一过程。
VDAC1寡聚化被认为可促进线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，或形成独立大孔道，进而触发线粒体膜电位崩塌和ROS爆发。为评估其下游后果，研究分离线粒体组分和细胞质组分，并通过免疫印迹和免疫荧光检测细胞色素c分布。光照降低线粒体内细胞色素c水平，并增加其在细胞质中的丰度，说明细胞色素c从线粒体释放，提示线粒体膜完整性受损。飞燕草素和VBIT-12均可在很大程度上阻止这一重新分布。细胞色素c是线粒体内膜相关蛋白，其出现在细胞质中是线粒体外膜通透性增加和膜完整性受损的直接证据。
研究进一步通过检测线粒体ROS和线粒体膜电位评估线粒体功能障碍。MitoSOX™ Red染色显示，光照增加661W细胞线粒体ROS水平，飞燕草素和VBIT-12均显著降低这一升高。与此同时，JC-1染色显示VBIT-12可恢复线粒体膜电位。越来越多证据也将VDAC1寡聚化与铁死亡联系起来。既往研究提示，VDAC1寡聚化可能促进线粒体血红素加氧酶-1（HO-1）释放至细胞质，从而参与铁死亡反应。为验证这一可能，研究对线粒体和细胞质组分中HO-1分布进行免疫印迹分析。结果显示，光照降低线粒体HO-1并增加细胞质HO-1，与HO-1从线粒体向细胞质转位一致。飞燕草素和VBIT-12均逆转了这种异常分布。同时，光照诱导的细胞内Fe²⁺升高也被VBIT-12显著抑制。
为进一步明确VDAC1在RPD中的作用，并检验其是否介导飞燕草素的保护效应，研究使用siRNA沉默661W细胞中的VDAC1。免疫印迹证实VDAC1被有效敲低，其表达降至si-Control组的59.63% ± 2.51%。在基础状态下，VDAC1敲低本身会引起线粒体膜电位轻度下降，这与VDAC1维持线粒体代谢稳态的生理作用一致。随后，研究在RPD模型中评估VDAC1沉默的功能后果。光照导致线粒体膜电位丧失、线粒体ROS增加，并引起关键铁死亡相关蛋白失调。VDAC1敲低可减轻这些变化，部分恢复线粒体膜电位、降低线粒体ROS积累，并使铁死亡相关分子标志物趋于正常。重要的是，在VDAC1沉默细胞中，飞燕草素对线粒体膜电位、线粒体ROS和铁死亡相关蛋白的保护效应减弱。这些结果提示，VDAC1是光诱导视网膜损伤的关键介导因子，并支持飞燕草素主要通过VDAC1依赖性调控线粒体稳态和铁死亡来保护RPD。
图6：飞燕草素调控VDAC1寡聚化以抑制光诱导视网膜细胞铁死亡。（A-C）EGS化学交联后通过WB分析VDAC1寡聚体形成。（D）细胞色素c（Cyto c，绿色）与线粒体标志物COX IV（红色）的免疫荧光共定位实验。白色箭头标示细胞质Cyto c。比例尺 = 10 μm。（E-H）亚细胞分级后通过WB分析并定量Cyto c亚细胞分布。（I-L）流式细胞术分析线粒体ROS（MitoSOX Red染色）。（M-P）WB分析并定量HO-1亚细胞分布。（Q-R）流式细胞术分析MMP（JC-1染色）。（S-T）流式细胞术分析Fe²⁺水平（FerroOrange染色）。定量数据以均值 ± SEM表示，n=3次独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Light组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
飞燕草素调控VDAC1-mtDNA-STING轴抑制视网膜感光细胞光诱导铁死亡
cGAS-STING通路是重要的细胞质DNA感知系统，广泛参与炎症和铁死亡调控。近期研究还提示该通路参与视网膜损伤及相关疾病。由于VDAC1是线粒体外膜的主要通道蛋白，其寡聚化可促进线粒体内容物异常释放，研究团队进一步检测光照是否以VDAC1寡聚化依赖方式诱导mtDNA泄漏，并由此激活cGAS-STING信号。
为回答这一问题，研究分离线粒体并提取细胞质DNA进行分析。结果显示，光照促进mtDNA从线粒体释放至细胞质，而VBIT-12和飞燕草素均抑制这一过程。随后，研究进一步分析mtDNA泄漏是否与下游cGAS-STING通路激活相关。免疫印迹结果显示，光照增加661W细胞中cGAS和STING蛋白丰度，而VBIT-12和飞燕草素均有效减弱这种增加。ELISA检测显示，细胞内cGAMP水平在光照后显著升高，而VBIT-12或飞燕草素处理均可降低cGAMP水平。cGAMP是cGAS响应细胞质DNA后生成的第二信使。
近期研究提示，活化的STING可通过自噬促进GPX4降解，从而削弱细胞抵御脂质过氧化的能力并增强铁死亡。鉴于光应激也可诱导自噬活性，研究进一步考察STING是否参与光诱导视网膜损伤中的GPX4丢失。661W细胞中的共免疫沉淀实验显示，STING与GPX4存在特异性相互作用。为评估这一相互作用的功能意义，研究使用siRNA沉默STING表达。STING敲低可在光照后恢复GPX4蛋白丰度，并显著降低细胞内脂质ROS积累。这些结果支持一种模型：在661W细胞中，STING负向调控GPX4，并在光诱导损伤过程中促进脂质过氧化和铁死亡。
图7：飞燕草素调控VDAC1-mtDNA-STING轴以抑制视网膜感光细胞光诱导铁死亡。（A）qPCR分析相对细胞质mtDNA（mtND1）拷贝数，并以β-actin归一化。（B-D）WB分析并定量cGAS和STING蛋白表达。（E）ELISA检测细胞cGAMP浓度。（F）qPCR分析相对细胞质mtDNA（mtND1）拷贝数，并以β-actin归一化。（G-I）WB分析并定量cGAS和STING蛋白表达。（K）STING（绿色）与GPX4（红色）的免疫荧光共定位实验。比例尺 = 10 μm。（L）STING与GPX4相互作用的共免疫沉淀实验。（M-N）WB分析敲低效率和GPX4蛋白表达。（O-P）流式细胞术分析脂质ROS水平（BODIPY 581/591 C11染色）。定量数据以均值 ± SEM表示，n=3次独立实验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Light组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
飞燕草素改善Sprague-Dawley大鼠光诱导视网膜损伤
为判断飞燕草素的保护作用是否可延伸至体内视网膜损伤，研究建立Sprague-Dawley大鼠RPD模型。大鼠在光照前连续4周每日灌胃给予飞燕草素，剂量为30或60 mg/kg/d。H&E染色组织学分析显示，光照导致感光细胞层明显细胞丢失，而飞燕草素处理可保留视网膜结构。TUNEL染色进一步显示，光照增加视网膜中TUNEL阳性细胞数量，而飞燕草素处理显著减少这一增加。
随后，研究评估视网膜组织中的氧化损伤。DHE染色显示，光照诱导视网膜中ROS大量积累，而飞燕草素显著减轻这一现象。与此一致，4-HNE免疫组织化学分析显示，光照增加视网膜组织脂质过氧化，而飞燕草素降低这一反应。免疫印迹进一步显示，飞燕草素抑制光诱导的cGAS和STING上调，并恢复GPX4蛋白丰度。这些结果与细胞实验一致，提示飞燕草素通过抑制cGAS-STING信号、限制氧化和脂质过氧化应激、维持GPX4表达来保护RPD。
图8：飞燕草素改善SD大鼠光诱导视网膜损伤。（A）视网膜矢状切片H&E染色。比例尺：500 μm（上图）、200 μm（下图）。（B、F）TUNEL染色（红色）及定量分析。细胞核：DAPI（蓝色）。比例尺 = 200 μm。（C、G）DHE染色（红色）及定量分析。比例尺 = 200 μm。（D、H）GPX4免疫组织化学染色（棕色）及阳性面积定量。比例尺 = 200 μm。（E、I）4-HNE免疫组织化学染色（棕色）及阳性面积定量。比例尺 = 200 μm。（J-M）WB分析并定量视网膜组织中cGAS、STING和GPX4表达。定量数据以均值 ± SEM表示。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001（与Light组相比，采用单因素方差分析，并进行Dunnett事后检验）。
【贡献】★★★★★
本研究通过整合ABPP和DARTS筛选，并结合CETSA和SPR验证，确认VDAC1是飞燕草素在RPD中的直接分子靶点。飞燕草素可抑制光氧化诱导的VDAC1羰基化及其病理性寡聚化，从而维持线粒体完整性，限制线粒体DNA泄漏，减弱cGAS-STING通路激活，维持GPX4蛋白稳定性，并最终抑制铁死亡。
据作者所述，本研究首次同时明确了飞燕草素在RPD中的直接靶点及其保护作用的整合机制。这些发现建立了一条此前未被充分认识的病理轴，即线粒体氧化损伤与先天免疫激活、铁死亡之间的联系，并为开发针对RPD及相关退行性疾病的靶向干预策略提供了机制框架。未来研究仍需进一步开展系统的药代动力学和药效学研究，以优化体内给药方案，并更精确地阐明飞燕草素暴露水平与治疗反应之间的关系。
